Protein Purification Protocols

1.1. How Much Do I Need?......Page 2 1.3. Do I Need a Completely Pure Protein?......Page 3 1.4. What Source Should I Use?......Page 5 2.1. Solubility......Page 6 2.2. Charge......Page 7 2.4. Specific Binding......Page 8 3. Documenting the Purification......Page 10 4. An Example......Page 11 1. Introduction......Page 16 2. Materials......Page 17 4. Notes......Page 18 1. Introduction......Page 22 2. Materials......Page 23 3.2. Extraction of Cereal Seed Proteins, Using a Modified Osborne Procedure......Page 24 3.3. Extraction of Proteins for SDS-PAGE Analysis......Page 25 4. Notes......Page 26 1. Introduction......Page 30 3.1. Lysis of Escherichia coli and Harvesting of Inclusion Bodies......Page 32 3.4. Refolding of Protein......Page 33 4. Notes......Page 34 1. Introduction......Page 38 3. Methods......Page 39 3.1. Extraction of Intracellular Proteins From Metarhiziumanisopliae......Page 40 3.2. Screening for Extracellular Enzymes......Page 41 4. Notes......Page 42 1. Introduction......Page 48 3.2. Subcellular Fractionation......Page 50 4. Notes......Page 51 1. Introduction......Page 54 2.2. Barley Protoplast and Chloroplast Preparation......Page 55 3.1.1. Wheat Protoplast Preparation......Page 56 3.1.4. Barley Chloroplast Preparation......Page 57 3.3. Assay of Plastid Intactness......Page 58 3.4. Assay of Photosynthetic Activity (CO2-Dependent Oxygen Evolution)of Chloroplasts......Page 59 3.6. Isolation of Mitochondria From Pea Leaves......Page 60 4. Notes......Page 62 1.1. The Problems......Page 66 1.2. Some Solutions......Page 68 2. Materials......Page 69 3.2. Ammonium Sulfate Fractionation of the Extract......Page 70 4. Notes......Page 71 5. Envoi......Page 74 1. Introduction......Page 76 1.1. Recognition of Proteolytic Attack......Page 77 1.2. Strategies for Prevention of Proteolysis......Page 78 1.3. Proteinases and Their Inhibition......Page 79 1.4. Assay of Endopeptidase Activity......Page 81 3.1. Method 1: Working Inhibitor Cocktails......Page 82 3.4. Method 4: Zymography......Page 83 4. Notes......Page 84 1. Introduction......Page 86 3.1. Precipitation With Ammonium Sulfate......Page 87 3.2. Forced Dialysis......Page 88 4. Notes......Page 89 1. Introduction......Page 92 2.1. Preparation of Buffers......Page 94 2.2. Dialysis......Page 95 3.2. Changing Buffers by Dialysis......Page 96 3.3. Changing Buffers by Gel Filtration......Page 97 4. Notes......Page 98 1.1. Membrane Processes......Page 102 1.2. UF Materials and Devices......Page 103 1.3. Operating Parameters......Page 109 1.4. Applications......Page 111 2. Materials......Page 113 3.1. Using a Stirred Cell for Concentration......Page 114 3.2. Protein and Peptide Recovery From Polyacrylamide Gels......Page 115 4. Notes......Page 116 1. Introduction......Page 118 2.2. Fractional Precipitation With Acetone......Page 119 3.2. Fractional Precipitation With Acetone......Page 121 4. Notes......Page 122 1. Introduction......Page 126 2. Materials......Page 128 3.2. Chromatography......Page 129 4. Notes......Page 130 1. Introduction......Page 134 2. Materials......Page 135 4. Notes......Page 136 1.1. General Principles......Page 140 1.2. Affinity Matrices......Page 142 1.3. Practical Aspects......Page 143 2. Materials......Page 146 3. Methods......Page 147 4. Notes......Page 148 1. Introduction......Page 152 2. Materials......Page 153 3.1. Screening Dye Ligands......Page 154 3.3. Example Purification: Isolation of Coenzyme A Synthase......Page 155 4. Notes......Page 156 1. Introduction......Page 160 2.2. Immobilization of Con A on Affigel 15......Page 162 3.3. Purification of Glycoproteins on Immobilized Con A......Page 163 4. Notes......Page 164 1.1. General Principles......Page 168 1.2. Practical Aspects......Page 169 1.3. Practical Aspects......Page 172 2.2. Immunopurification......Page 174 3.3. Immunoaffinity Purification of Target Protein From Crude Extract......Page 175 4. Notes......Page 176 1. Introduction......Page 180 2. Materials......Page 182 2.1. Stationary Phase for IMAC......Page 183 2.3. Buffers......Page 184 3.2. Elution of Adsorbed Proteins......Page 185 3.5. High-Performance IMAC......Page 186 4. Notes......Page 188 1. Introduction......Page 192 4. Notes......Page 193 1. Introduction......Page 196 2.2. Commercially Available Matrices......Page 198 3.1. Thiophilic Chromatography......Page 200 3.3. Hydrophobic Charge Induction Chromatography......Page 202 4. Notes......Page 203 1.1. Overview......Page 206 1.3. Structural and Kinetic Requirements for Affinity PrecipitationWith Bis-Coenzymes......Page 207 2.1. Synthesis of Coenzyme Derivatives......Page 210 2.3. Enzyme Purification......Page 213 3.1. Synthesis of Coenzyme Derivatives......Page 214 3.3. Enzyme Purification Protocols......Page 217 4. Notes......Page 220 References......Page 222 1. Introduction......Page 226 3.1. Gel Preparation......Page 227 3.2. Sample Application......Page 229 3.6. Collection of the Zones......Page 230 3.7. Separation of the Protein From the Carrier Ampholytes......Page 231 4. Notes......Page 232 References......Page 233 2.1. Buffers......Page 234 4. Notes......Page 235 References......Page 238 1. Introduction......Page 240 2.1. Equipment......Page 242 2.3. Selection of Matrix......Page 245 3.2. Preparation and Packing......Page 247 3.5. Evaluation of Column Packing......Page 248 3.6. Standards and Calibration......Page 249 3.8. Column Cleaning and Storage......Page 250 4. Notes......Page 251 References......Page 252 2. Materials......Page 254 3.3. Scouting FPLC Methods......Page 256 4. Notes......Page 257 References......Page 259 1. Introduction......Page 260 1.1. Principle of Separation......Page 261 1.2. RP-HPLC Columns......Page 262 1.3. Mobile Phase......Page 267 1.4. Temperature......Page 272 2.1. Equipment......Page 273 2.5. Detector......Page 274 2.6. Protein Sample......Page 276 4. Notes......Page 277 References......Page 281 1.1. Peripheral Membrane Proteins......Page 284 1.2. Integral Membrane Proteins......Page 285 1.3. Experimental Design......Page 288 2.4. Extraction of the Intrinsic Enzyme Ca2-ATPaseFrom Sarcoplasmic Reticulum......Page 289 3.2. Extraction of the Extrinsic Calcium-Binding Protein CalsequestrinFrom Sarcoplasmic Reticulum......Page 290 3.5. Assay of Ca2-ATPase Activity......Page 291 4. Notes......Page 292 References......Page 293 1. Introduction......Page 296 3. Methods......Page 299 4. Notes......Page 300 References......Page 301 1. Introduction......Page 302 2.1. Isolation of Crude Egg Surface Membrane Complex......Page 303 2.3. Lectin Affinity Chromatography......Page 304 3.2. Solubilization of Sperm Receptor Complex......Page 305 4. Notes......Page 306 References......Page 308 1. Introduction......Page 310 2. Materials......Page 312 3.1. Operation of Freeze-Dryer......Page 313 3.2. Freezing......Page 316 3.3. Primary Drying......Page 318 3.5. Quality Indices......Page 319 4. Notes......Page 320 References......Page 321 1. Introduction......Page 324 2. Materials......Page 325 3.1. Prevention of Bacterial Contamination......Page 326 3.3. Use of Stabilizing Additives......Page 327 3.4. Low-Temperature Storage......Page 331 3.6. Stability Analysis and Accelerated Degradation Testing......Page 332 4. Notes......Page 334 References......Page 336 1. Introduction......Page 340 3.1. Gel Staining......Page 341 3.2. Electroelution......Page 342 3.3. Protein Precipitation......Page 343 References......Page 344 1. Introduction......Page 346 3.1. Electroblotting......Page 348 3.2. Protein Staining......Page 349 4. Notes......Page 350 References......Page 352 1. Introduction......Page 354 3.1. Sample Preparation......Page 356 3.3. Second Dimension: SDS-PAGE......Page 357 4. Notes......Page 359 References......Page 360 1. Introduction......Page 362 2. Materials......Page 364 3.2. Preparation of Acrylamide/Immobiline Partition Membranesat Desired pHs......Page 367 3.3. Loading Samples and Assembling μsol-IEF Chambers......Page 369 3.4. Electrophoretic Conditions......Page 370 4. Notes......Page 371 References......Page 374 38 Practical Column Chromatography......Page 378 39 Detection Methods......Page 390 40 Peptide Proteomics......Page 412 41 Multidimensional Liquid Chromatography of Proteins......Page 426 42 Mass Spectrometry......Page 448 43 Purification of Therapeutic Proteins......Page 456 44 Purification Process Scale-Up......Page 464